Die Gemäldegalerie wurde seit ihrer Gründung im Jahre 1830 nach kunsthistorischen Gesichtspunkten aufgebaut und vervollständigt. Diesem kontinuierlichen Überblick über die europäische Malerei vom 13. bis zum 18. Jahrhundert verdankt die Sammlung ebenso ihren Weltrang wie den zahlreichen unvergleichlichen Meisterwerken aller kunsthistorischen Epochen, die sie beherbergt.
Ein fast zwei Kilometer langer Rundgang durch 72 Säle und Kabinette führt im Haus am Kulturforum durch einzelne Kunstlandschaften und Epochen. Ausgestellt sind rund 1.200 Meisterwerke bedeutender Künstler*innen. Der Rundgang durch das Haus lädt dazu ein, die einzelnen Sammlungsbereiche, Kunstschulen und Stilepochen zu entdecken. Sammlungsschwerpunkte bilden die deutsche und italienische Malerei des 13. bis 16. und die niederländische Malerei des 15./16. Jahrhunderts. Gemälde des Mittelalters und der Renaissance reichen von den großen Italienern Giotto, Fra Angelico, Raffael und Tizian über den Flamen Jan van Eyck und die detailreichen Bilder des Niederländers Pieter Breugel bis zu den altdeutschen Meistern wie Konrad Witz, Albrecht Dürer, Hans Baldung Grien, Lucas Cranach und Hans Holbein.
Der Saal mit Werken Rembrandts ist durch seine zentrale Lage im Museum hervorgehoben. Die Sammlung gehört mit 20 Arbeiten des Künstlers zu den größten und qualitätvollsten der Welt. Sie wird begleitet von weiteren Gemälden der holländischen und flämischen Malerei des 17. Jahrhunderts: Porträts, Genrebilder, Interieurs, Landschaften und Stillleben zeugen von der Spezialisierung der Künstler auf bestimmte Themen. Die glanzvolle Gemäldesammlung italienischer, französischer, deutscher und englischer Malerei des 18. Jahrhunderts enthält Werke von Canaletto, Jean-Antoine Watteau, Antoine Pesne und Thomas Gainsborough.
Zur Information stehen den Besucher*innen die Kataloge der Sammlung sowie Audio-Führungen auf Deutsch und Englisch zur Verfügung.
Die Gemäldegalerie als öffentliche Institution wurde 1830 in dem von Karl Friedrich Schinkel entworfenen Königlichen Museum am Lustgarten, dem heutigen Alten Museum, eröffnet. Der Kunstbesitz des Großen Kurfürsten und Friedrichs des Großen bildete im 17./18. Jahrhundert den Grundstock der Kollektion. Der erste Galeriedirektor Gustav Friedrich Waagen ordnete die Berliner Sammlung erstmals in Europa nach systematisch-wissenschaftlichen Kriterien und erweiterte sie kontinuierlich.
Ihren internationalen Ruf verdankt die Galerie Wilhelm von Bode, der von 1890 bis 1929 ihr Direktor war. Ihm gelangen durch Kennerschaft und großes Engagement bedeutende Erwerbungen. Dadurch konnte eine fast vollständige Übersicht über die europäische Malerei seit dem 13. Jahrhundert erreicht werden.
1904 zog die Galerie mit ihren gewachsenen Beständen in das neu erbaute Kaiser Friedrich-Museum, heute Bode-Museum, das als Museum der Renaissance konzipiert war, auf die Museumsinsel um. Bode veranlasste wohlhabende Bürger zur finanziellen Unterstützung von Kunstankäufen und gründete bereits im Jahre 1897 den noch heute aktiven Kaiser Friedrich-Museums-Verein.
Der Zweite Weltkrieg beendete die kontinuierliche Entwicklung der Sammlung. Das Museum selbst wurde stark beschädigt. Über 400 großformatige Werke gingen durch den Krieg verloren. Überdies führte die Spaltung der Stadt auch zu einer Teilung der Sammlung. Von nun an gab es zwei Ausstellungsorte: Bis 1997 war die Gemäldegalerie in Berlin-Dahlem und im Bode-Museum auf der Museumsinsel in Berlin-Mitte untergebracht. Nach einer über fünfzig Jahre währenden Teilung kann die Sammlung seit 1998 am Kulturforum wieder in ihrer ursprünglichen Pracht gezeigt werden. Um sie im Zusammenhang mit den zur Zeit der Gemälde entstandenen Skulpturen in einen engen Dialog treten zu lassen, ist geplant, sie künftig an ihren historischen Ort, auf die Museumsinsel Berlin, zurückkehren zu lassen.